Fluoreszenzmarkierte Zellinien (fluorescently tagged cell lines) tragen ein markiertes Protein. Sie eignen sich damit perfekt zur Live-Beobachtung unter einem Fluoreszensmikroskop. Je nach Zelllinie lassen sich Strukturen wie das Zytoskelett, Zell-Zell-Verbindungen oder Vesikeltransportwege live verfolgen.
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Immunhistochemie oder fluoreszenzmarkierte Zelllinien – was ist der Unterschied?
Wenn Sie Zellen fixieren und mit Immunhistochemie verschiedene Strukturen sichtbar machen, erhalten Sie eine Momentaufnahme. Einerseits erlaubt Ihnen die Immunhistochemie, eine große Zahl verschiedener Strukturen zu untersuchen in Zellkultur oder im Gewebepräparat. Andererseits können bei der Fixierung Artefakte entstehen. Außerdem müssen Sie jedes Experiment sorgfältig planen, damit sich die Antikörper vertragen. Die Immunhistochemie erfordert einige Arbeitsschritte zwischen der Zellkultur und dem Mikroskop.
Mit fluoreszenzmarkierten Zelllinien dagegen können Sie einzelne Proteine in lebenden Zellen sichtbar machen. Beim Live Cell Imaging können Sie beobachten, wie sich das Zytoskelett aufbaut oder wie sich Vesikel durch die Zelle bewegen. Sie können auch die ganze Zelle markieren, zum Beispiel mit cytosolischem tGPF, und beobachten, wie sich die vielen Zellen in der Schale anordnen und verbinden. Eine fluoreszenzmarkierte Zelllinie können Sie sofort unters Mikroskop legen, ohne Fixierungs- oder Färbeschritte.
Was ist markiert in einer fluoreszenzmarkierten Zelllinie?
Theoretisch lässt sich jede Struktur in der Zelle mit einem fluoreszierenden Marker versehen: Bestandteile des Zytoskeletts wie Mikrotubuli oder Aktinfilamente; Sarkomere in Muskelzellen; Motorproteine wie Kinesin; die Kernmembran oder Vesikelmembranen. Auch das Zytosol lässt sich markieren, zum Beispiel mit gelöstem tGFP. Welche Struktur Sie mit einem fluoreszenten Marker versehen wollen, hängt ganz von der Fragestellung und vom Versuchsaufbau ab.
So werden fluoreszente Zellinien hergestellt
Eine fluoreszenzmarkierte Zelllinie geht hervor aus einer immortalisierten Kultur-Zelllinie. Mittels verschiedenen Methoden wird in die DNA der Zellen ein Gen für ein fluoreszierendes Protein stabil eingebracht. Entweder wird das Gen an eine beliebige nicht-kodierende Stelle im Genom eingesetzt, damit die Zelle ein fluoreszierendes Protein herstellt und frei im Zytosol exprimiert. Oder aber der Fluoreszenzmarker wird angehängt an die codierende Gensequenz für ein bestimmtes Protein, um dieses mit einem leuchtenden Marker zu versehen. Es entsteht ein Hybrid-Protein, zum Beispiel Aktin-GFP.
Fluoreszenzmarkierte Zelllinien kaufen oder selbst herstellen?
Sollten Sie eine markierte Zelllinie von extern kaufen oder sie selbst herstellen? Das kommt auf Ihr Experiment an. Wenn eine passende Zelllinie erhältlich ist, sparen Sie sich Zeit und Nerven, wenn Sie die Zellen kaufen. Sie können sich auf Ihr eigenes Experiment konzentrieren und brauchen nicht das Rad neu zu erfinden.
Finden Sie auf dem Markt keine passende Linie, müssen Sie selbst zum Gene-Editing greifen. Das Wichtigste ist hier die Planung. Entscheiden Sie vorab, welche Struktur Sie sichtbar machen wollen. Ist es das Zytosol, oder wollen Sie eine bestimmte Struktur beobachten? Wenn Sie ein Protein markieren wollen, lautet die nächste Frage: An welche Domäne des Zielproteins können Sie das Etikett anhängen, ohne Struktur und Funktion des Ausgangsproteins zu stören? Datenbanken und 3D-Modelle helfen Ihnen bei der Planung.
Die eigentliche Herstellung: Elektroporation oder CRISPR-Cas
Auf die Planung folgt die eigentliche Arbeit: Eine fluoreszenzmarkierte Zelllinie herstellen. Die Quick-and-Dirty-Methode hierfür ist die Elektroporation. Bei dieser Methode wird Fremd-DNA an eine beliebige Stelle im Genom eingebaut. Die Elektroporation eignet sich deshalb nur, wenn Sie ein fluoreszentes Protein im Zytosol Ihrer Zelllinie haben wollen. Um ein einzelnes Protein mit einem fluoreszenten Marker zu versehen, müssen Sie die DNA Ihrer Zellen mit CRISPR/Cas editieren.
In beiden Fällen ist es hinterher leicht, die Zellen auszuwählen, bei denen das Gen für die Fluoreszenz stabil eingebaut wurde: Es sind diejenigen Zellen, die leuchten. Dennoch lohnt sich ein Sequenzierungs-Schritt, um zu überprüfen, dass die Fremd-DNA an der richtigen Stelle ins Genom eingebaut wurde (bei CRISPR) oder um herauszufinden, an welcher Stelle die Sequenz gelandet ist (bei Elektroporation).
